二级结构是由生物大分子在原子分辨率结构中所观察到的氢键来定义的。蛋白质的二级结构通常是以主链中氨基之间的氢键模式来定义〈与主链-侧链间以及侧链-侧链间的氢键无关〉,亦即DSSP的定义。而核酸的二级结构是以碱基之间的氢键来定义。
在二级结构中,特定的氢键模式往往伴随着其他一些结构特征;但如果只考虑这些结构特征而忽略氢键本身,则会导致所定义的二级结构不准确。例如,蛋白质的螺旋中的残基都分布在拉氏图(以主链二面角为坐标)的特定区域,因此二面角位于这一区域的残基都会被认为参与形成“螺旋”,而不论它是否真正的存在对应氢键。其他稍微不准确的定义多是应用曲线微分几何的观念,如曲率及扭量。也有一些结构生物学家以肉眼观察通过软件显示的蛋白质结构来决定其二级结构。
对生物大分子的二级结构含量可以以光谱来初步估计。对于蛋白质,最常用的方法是圆二色性(Circular dichroism), (利用长紫外线,波长范围170-250...