染色流程及原理

流程可概括为：染色-脱色-复染。

第一步初染剂（Primary Stain）：使用结晶紫染色，染色部位主要为染细胞壁上的肽聚糖。

第二步媒染剂（Mordant）

加入复方碘溶液或称革兰氏碘液（Gram"s Iodine）后会形成不溶性的结晶紫-碘（CV-I）复合体。细菌呈紫黑色。第二步是关键，它的目的是分辨细菌的革兰氏染色特性。若为革兰氏阳性菌，此复合体系结合于细胞壁之镁、核糖核酸（Magnesium Ribonucletic Acid），形成镁-核糖核酸-结晶紫-碘（Mg-RNA-CV-I）复合体，不易脱去。

第三步脱色剂（Decoloring Agent）

使用酒精（95%）脱色，试剂具脂溶剂（Lipid Solvent）和蛋白脱水剂（Protein Dehydrating Agent）之双重功能。此步骤对革兰氏阳性细菌无效，因为细胞壁上厚厚的细胞壁(成分为肽聚糖)阻隔了结晶紫-碘复合体的外渗，只能留在细菌体内。革兰氏阴性菌细胞壁层薄，会被脱色而成为无色。

第四步复染剂（Counterstain）

为了对比，在此之后会加入番红（Safranin）进行复染，革兰氏阴性菌成红色，而革兰氏阳性菌仍保有原来的紫色。

定性

KOH-试验

另外的一种方法是氢氧化钾-试验。将培养好的细菌取出一小部分，使其悬浮于一滴KOH溶液中。革兰氏阳性菌与之不发生反应，用细针穿过该溶液，溶液呈正常液体状。革兰氏阴性菌因细胞壁中主要成分为脂多糖，脂质含量较高，接触强碱KOH后与KOH发生皂化反应，以细针穿过会有明显黏稠状

氨肽酶试验

除了个别例外，只有革兰氏阴性菌才能证明氨肽酶的存在。这是该试验的基础。 将要进行试验的细菌放入试管加水。放入一张显示肽酶活性的试纸，在37°C下等待10到35分钟，试纸变成深黄色。

实验方法

药品

结晶紫：作为初染剂

碘液：作为媒染剂

酒精：浓度为95%，作为脱色剂

番红：复染剂

实验器材

实验菌种、接种环、蒸馏水、玻片、酒精灯、吸水纸、显微镜

实验步骤

将菌种抹于玻片上，并置于酒精灯上加以热固定。

将结晶紫滴于玻片上，静置一分钟后用蒸馏水洗去多余的结晶紫。

将碘液滴于玻片上，静置一分钟后，用蒸馏水洗去多余的碘液。

酒精脱色，直至无结晶紫的颜色流出为止。

以番红复染，约45秒后用蒸馏水洗去。

用吸水纸将多余的水吸干后，即可置于显微镜下观察。

注意事项：

以酒精灯烘干玻片时，应避免热源持续对同一点加热，以免玻片破掉。

以蒸馏水洗去多余药品时，应避免直接冲洗到样品的位置，可将玻片与水平面呈一个角度，使蒸馏水由玻片较高处往样品处流去。

此实验的标准作法应于无菌的状态下操作。

本实验可以大肠杆菌为实验组和金黄葡萄球菌作为对照组。

实验结果

革兰氏阳性菌呈现紫色，或更深的蓝黑色。

革兰氏阴性菌呈现粉红色或红色。

  大肠杆菌(革兰氏阴性菌)染色结果

 金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌)染色结果

参考文献

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