磷酸化（英语：Phosphorylation）或称磷酸化作用，是指在蛋白质或其他类型分子上，加入一个磷酸（PO32-）基团，也可定义成“将一个磷酸基团导入一个有机分子”。此作用在生物化学中占有重要地位。
蛋白质磷酸化可发生在许多种类的氨基酸（蛋白质的主要单位）上，其中以丝氨酸为多，接着是苏氨酸。而酪氨酸则相对较少磷酸化的发生，不过由于经过磷酸化之后的酪氨酸较容易利用抗体来纯化，因此酪氨酸的磷酸化作用位置也较广为了解。
除了蛋白质以外，部分核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鸟苷（GTP）的形成，也是经由二磷酸腺苷和二磷酸鸟苷的磷酸化而来，此过程称为氧化磷酸化。另外在许多糖类的生化反应中（如糖解作用），也有一些步骤存在氧化磷酸化作用。
